해니(로버트 도나트 분)는 캐나다에서 업무차 런던에 온다. 어느날 쇼구경을 갔다가 아나벨라(루시 맨하임 분)라는 묘령의 여인을 만난다. 이 여인은 해니를 따라 아파트까지 와서는 자신이 스파이이며 지금 쫓기고 있다고 말한다. 또한 스파이들이 영국 공군의 기밀을 외국에 넘기려 하고 있으며 자신이 그것을 막아야 한다고 한다. 그녀는 '39 계단'이라는 알 수 없는 암호를 이야기한다. 그러나 그날밤 아나벨라는 살해된다. 해니는 아나벨라가 얘기한 사람을 만나기 위해 스코틀랜드로 떠난다. 기차 안에서 해니는 자신이 아나벨라의 살인범으로 몰리고 있음을 발견한다. 또한 아나벨라를 살해한 스파이들에게도 쫓겨 해니는 파멜라(마델레인느 캐롤린 분)에게 도움을 청하나 거절당한다. 겨우 기차에서 탈출한 해니는 스코틀랜드의 어느 농가에서 하룻밤을 지내고 그 농가 아낙의 도움으로 다시 경찰의 추적에서 벗어난다. 구사일생으로 교수(고드프리 터얼 분)의 집에 도착한 해니는 교수가 스파이 두목이라는 것을 안다. 교수의 집에서도 탈출한 해니는 경찰에 가서 사실을 말하지만 아무도 믿어주지 않는다. 다시 경찰서에서 도망치게 되고 결국엔 파멜라의 신고로 경찰로 위장한 스파이들에게 잡히고 만다. 파멜라가 위험하다고 느낀 스파이들은 파멜라와 해니를 수갑으로 묶어 두지만 해니는 또다시 탈출한다. 결국 파멜라도 해니의 말을 믿게 되고 스파이 두목인 교수가 39계단에게 경고를 하려하며 런던 극장에서 기밀을 넘겨받아 국외로 탈출하려한다는 사실을 알게 된다. 파멜라는 런던 경시청에 가서 사실을 알리나 이들 또한 믿지 않는다. 런던 극장으로 간 해니는 뛰어난 기억력을 자랑하는 '미스터 메모리'라는 사람이 바로 기밀을 두뇌에 저장한 사람이며 이 자를 데리고 가려 한다는 것을 알게 된다.